Флуоресцентният филтър е съществен компонент във флуоресцентния микроскоп. Типичната система има три основни филтъра: възбуждащ филтър, емисионен филтър и дихроично огледало. Те обикновено са опаковани в куб, така че групата да се вмъкне заедно в микроскопа.
Как работи флуоресцентният филтър?
Филтър за възбуждане
Възбуждащите филтри пропускат светлина с определена дължина на вълната и блокират други дължини на вълната. Те могат да се използват за създаване на различни цветове чрез настройка на филтъра, така че да пропуска само един цвят. Филтрите за възбуждане се предлагат в два основни типа — дългопропускащи филтри и лентови филтри. Възбудителят обикновено е лентов филтър, който пропуска само дължините на вълните, абсорбирани от флуорофора, като по този начин минимизира възбуждането на други източници на флуоресценция и блокира възбуждащата светлина в лентата на флуоресцентно излъчване. Както е показано от синята линия на фигурата, BP е 460-495, което означава, че може да премине само през флуоресценция от 460-495 nm.
Той се поставя в рамките на пътя на осветяване на флуоресцентен микроскоп и филтрира всички дължини на вълните на светлинния източник, с изключение на обхвата на възбуждане на флуорофора. Минималното предаване на филтъра диктува яркостта и блясъка на изображенията. Препоръчва се минимум 40% предаване за всеки филтър за възбуждане, така че предаването в идеалния случай да е >85%. Широчината на честотната лента на възбуждащия филтър трябва да бъде изцяло в обхвата на възбуждане на флуорофора, така че централната дължина на вълната (CWL) на филтъра да е възможно най-близо до пиковата дължина на вълната на възбуждане на флуорофора. Оптичната плътност (OD) на филтъра за възбуждане диктува тъмнината на фоновото изображение; OD е мярка за това колко добре филтърът блокира дължините на вълните извън обхвата на предаване или честотната лента. Препоръчва се минимална OD от 3,0, но OD от 6,0 или повече е идеална.
Емисионен филтър
Емисионните филтри служат за целта да позволят на желаната флуоресценция от пробата да достигне до детектора. Те блокират по-късите дължини на вълните и имат високо предаване за по-дълги дължини на вълните. Типът филтър също е свързан с число, например BA510IF на фигурата (филтър за бариери за смущения), това обозначение се отнася до дължината на вълната при 50% от нейното максимално предаване.
Същите препоръки за възбуждащи филтри важат и за емисионните филтри: минимално предаване, честотна лента, OD и CWL. Емисионен филтър с идеална комбинация CWL, минимално предаване и OD осигурява възможно най-ярките изображения, с възможно най-дълбоко блокиране и гарантира откриването на най-слабите емисионни сигнали.
Дихроично огледало
Дихроичното огледало се поставя между филтъра за възбуждане и филтъра за емисии под ъгъл от 45° и отразява сигнала за възбуждане към флуорофора, докато предава сигнала за излъчване към детектора. Идеалните дихроични филтри и разделители на лъчи имат резки преходи между максимално отражение и максимално предаване, с >95% отражение за честотната лента на възбуждащия филтър и предаване от >90% за честотната лента на емисионния филтър. Изберете филтъра, като вземете предвид дължината на вълната на пресичане (λ) на флуорофора, за да минимизирате разсеяната светлина и да увеличите съотношението сигнал/шум на флуоресцентното изображение.
Дихроичното огледало на тази фигура е DM505, наречено така, защото 505 нанометра е дължината на вълната при 50% от максималното предаване за това огледало. Кривата на предаване за това огледало показва високо предаване над 505 nm, рязък спад в предаването вляво от 505 нанометра и максимална отразяваща способност вляво от 505 нанометра, но все още може да има известно предаване под 505 nm.
Каква е разликата между дългопропускащи и лентови филтри?
Флуоресцентните филтри могат да бъдат разделени на два типа: дългопропускащи (LP) и лентови пропускащи (BP).
Дългопропускащите филтри предават дълги вълни и блокират по-късите. Дължината на вълната на прекъсване е стойността при 50% от пиковото предаване, а всички дължини на вълната над границата се предават от филтрите за дълго преминаване. Те често се използват в дихроични огледала и емисионни филтри. Дългочестотните филтри трябва да се използват, когато приложението изисква максимално събиране на емисии и когато спектралната дискриминация не е желателна или необходима, което обикновено е случаят със сонди, които генерират един излъчващ вид в проби с относително ниски нива на фонова автофлуоресценция.
Лентово пропускащите филтри предават само определена лента с дължина на вълната и блокират други. Те намаляват кръстосаните смущения, като позволяват предаването само на най-силната част от спектъра на емисиите на флуорофора, намаляват шума от автофлуоресценцията и по този начин подобряват съотношението сигнал/шум в проби с автофлуоресценция с висок фон, което филтрите за дълго преминаване не могат да предложат.
Колко вида комплекти флуоресцентни филтри може да достави BestScope?
Някои често срещани видове филтри включват сини, зелени и ултравиолетови филтри. Както е показано в таблицата.
| Комплект филтри | Филтър за възбуждане | Дихроично огледало | Бариерен филтър | LED лампа Дължина на вълната | Приложение |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485 nm | ·FITC: Метод на флуоресцентни антитела ·Ацидин портокал: ДНК, РНК · Аурамин: туберкулозен бацил ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535 nm | · Родамин, TRITC: Метод на флуоресцентни антитела ·Пропидиев йодид: ДНК ·RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365 nm | · Автофлуоресцентно наблюдение ·DAPI: ДНК оцветяване ·Hoechest 332528, 33342: използва се за оцветяване на хромозоми |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405 nm | · Катехоламини · 5-хидрокси триптамин · Тетрациклин: Скелет, Зъби |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640 nm | · Cy5 · Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Комплектите филтри, които се използват при флуоресцентни придобивания, са проектирани около основните дължини на вълните, използвани във флуоресцентните приложения, които се основават на най-използваните флуорофори. Поради тази причина те също са кръстени на флуорофора, за който са предназначени за изображения, като филтърни кубове DAPI (синьо), FITC (зелено) или TRITC (червено).
| Комплект филтри | Филтър за възбуждане | Дихроично огледало | Бариерен филтър | LED лампа Дължина на вълната |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485 nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365 nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535 nm |
| FL-Аурамин | BP470 | DM480 | BA485 | 450 nm |
| Тексаско червено | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560 nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560 nm |
Как избирате флуоресцентен филтър?
1. Принципът на избор на флуоресцентен филтър е да позволите на флуоресцентната/емисионната светлина да премине през края на изображението, доколкото е възможно, и напълно да блокира възбуждащата светлина в същото време, така че да се получи най-високото съотношение сигнал/шум. Особено за прилагането на микроскоп с многофотонно възбуждане и пълно вътрешно отражение, слабият шум също ще причини големи смущения в ефекта на изображението, така че изискването за съотношение сигнал / шум е по-високо.
2. Познайте спектъра на възбуждане и излъчване на флуорофора. За да се конструира набор от флуоресцентни филтри, който генерира висококачествено изображение с висок контраст с черен фон, филтрите за възбуждане и излъчване трябва да постигнат високо предаване с минимални вълни на лентата на пропускане в областите, които съответстват на пиковете на възбуждане на флуорофора или емисиите.
3. Помислете за издръжливостта на флуоресцентните филтри. Тези филтри трябва да са непроницаеми за източници на интензивна светлина, които генерират ултравиолетова (UV) светлина, която може да доведе до „прегаряне“, особено на възбудителния филтър, тъй като той е подложен на пълния интензитет на източника на светлина.
Различните флуоресцентни примерни изображения
Ресурсите са събрани и организирани в Интернет и се използват само за обучение и комуникация. Ако има някакво нарушение, моля, свържете се с нас, за да изтрием.
Време на публикуване: 09 декември 2022 г